Kalıtsal hastalıkların teşhisi için moleküler genetik yöntemler

DNA teknolojisi yöntemleri, belirli kalıtsal patoloji biçimlerinin kökeninden sorumlu olan belirli bir kromozomdaki mutant bir genin lokalizasyonunu belirlemek için kullanılır. Bir gen, DNA'nın bir bölümü olduğundan ve bir gen mutasyonu, DNA'nın birincil yapısındaki hasar olduğundan (mutasyon, lokalizasyonları ve bir bireyin yaşayabilirliği üzerindeki etkileri ne olursa olsun, DNA dizisindeki tüm değişiklikler olarak anlaşılır), daha sonra, kalıtsal bir hastalığı olan bir hastanın metafaz kromozomlarının preparatlarını araştırarak, patolojik genin lokalizasyonunu belirlemek mümkündür. Moleküler genetik yöntemler, hastalıkları değiştirilmiş DNA yapısı düzeyinde teşhis etme fırsatları yaratır, kalıtsal bozuklukların lokalizasyonunu belirlememize olanak tanır. Moleküler genetik yöntemler, tek bir bazın bile değiştirilmesiyle ilişkili mutasyonları belirleyebilir.

Gen tanımlamasının en önemli aşaması izolasyonudur. DNA, çekirdek içeren her türlü doku ve hücreden izole edilebilir. DNA izolasyonunun aşamaları şunlardır: hücrelerin hızlı lizi, hücre organelleri ve zarlarının parçalarının santrifüjleme ile çıkarılması, proteinlerin enzimatik yıkımı ve fenol ve kloroform kullanılarak çözeltiden ekstraksiyonu, DNA moleküllerinin etanolde çökeltilerek konsantrasyonu.

Genetik laboratuvarlarında DNA çoğunlukla kan lökositlerinden izole edilir, bunun için hastadan 5-20 ml venöz kan, antikoagülan solüsyonlu (heparin) steril bir test tüpüne alınır. Daha sonra lökositler ayrılır ve yukarıdaki adımlara göre işlenir.

Araştırma için materyal hazırlamanın bir sonraki aşaması, bakteriyel enzimler - restriksiyon endonükleazları (restriksiyon enzimleri) kullanılarak gerçekleştirilen, kesinlikle spesifik bir baz dizisine sahip alanlarda DNA'yı parçalara "kesmektir". Restriksiyon enzimleri, çift sarmallı bir DNA molekülünde 4-6, daha az sıklıkla 8-12 nükleotidin spesifik dizilerini tanır ve onu restriksiyon bölgeleri adı verilen bu dizilerin yerlerinde parçalara böler. Elde edilen DNA restriksiyon parçalarının sayısı, restriksiyon bölgelerinin oluşma sıklığına göre belirlenir ve parçaların boyutu, bu bölgelerin orijinal DNA molekülünün uzunluğu boyunca dağılımının doğasına göre belirlenir. Restriksiyon bölgeleri ne kadar sık bulunursa, restriksiyondan sonra DNA parçaları o kadar kısa olur. Şu anda, bakteriyel kökenli 500'den fazla farklı restriksiyon enzimi türü bilinmektedir ve bu enzimlerin her biri kendi spesifik nükleotit dizisini tanır. Gelecekte, restriksiyon bölgeleri DNA'nın genetik belirteçleri olarak kullanılabilir. Restriksiyon sonucu oluşan DNA parçaları, agaroz veya poliakrilamid jelde elektroforezle uzunluğa göre sıralanabilir ve böylece moleküler ağırlıkları belirlenebilir. Tipik olarak, bir jeldeki DNA, spesifik boyama (genellikle etidyum bromür) ve jelin iletilen ultraviyole ışıkta görüntülenmesiyle tanımlanır. DNA lokalizasyon bölgeleri kırmızı renktedir. Ancak, insanlarda, DNA birkaç restriksiyon enzimi tarafından işlendiğinde, elektroforezle ayrılamayacak kadar çok sayıda farklı uzunlukta parça oluşur, yani elektroforezde tek tek DNA parçalarını görsel olarak tanımlamak mümkün değildir (jelin tüm uzunluğu boyunca düzgün boyama elde edilir). Bu nedenle, böyle bir jelde istenen DNA parçalarını tanımlamak için, etiketli DNA problarıyla hibridizasyon yöntemi kullanılır.

DNA veya RNA'nın herhangi bir tek sarmallı parçası, guaninin her zaman sitozine ve adeninin timine bağlanmasıyla tamamlayıcı bir sarmalla bağlanma (hibridizasyon) yeteneğine sahiptir. Çift sarmallı bir molekül bu şekilde oluşur. Klonlanmış bir genin tek sarmallı bir kopyası radyoaktif bir etiketle etiketlenirse, bir prob elde edilir. Prob, daha sonra otoradyografi kullanılarak kolayca tanımlanan tamamlayıcı bir DNA segmentini bulma yeteneğine sahiptir. Gerilmiş kromozomların bir preparatına eklenen radyoaktif bir prob, genin belirli bir kromozomda lokalize edilmesini sağlar: Bir DNA probu kullanılarak, Southern blotting sırasında belirli alanlar tanımlanabilir. Test edilen DNA bölümü normal bir gen içeriyorsa hibridizasyon meydana gelir. Anormal bir nükleotid dizisinin mevcut olduğu, yani karşılık gelen kromozom yapılarının mutant bir gen içerdiği durumda, hibridizasyon meydana gelmez ve bu da patolojik genin lokalizasyonunun belirlenmesine olanak tanır.

DNA probları elde etmek için gen klonlama yöntemi kullanılır. Yöntemin özü, bir gene veya bir gen bölümüne karşılık gelen bir DNA parçasının bir klonlama partikülüne, genellikle bir bakteri plazmidine (bakteri hücrelerinde bulunan ve antibiyotik direnç genleri taşıyan halka şeklindeki kromozom dışı DNA) yerleştirilmesi ve ardından yerleştirilen insan genine sahip plazmidli bakterilerin çoğaltılmasıdır. Plazmiddeki sentez süreçleri sayesinde insan geninin veya bölümünün milyarlarca kopyası elde edilebilir.

Elde edilen DNA kopyaları, radyoaktif bir etiketle veya florokromlarla işaretlenerek, incelenen DNA molekülleri havuzunda tamamlayıcı dizileri aramak için prob olarak kullanılır.

Günümüzde gen mutasyonlarını teşhis etmek için DNA probları kullanan pek çok farklı yöntem bulunmaktadır.

[ 1 ], [ 2 ], [ 3 ], [ 4 ], [ 5 ], [ 6 ], [ 7 ]