Osteoartrit patogenezinde enzimlerin ve sitokinlerin rolü

Son yıllarda, araştırmacıların büyük ilgisi osteoartrozda eklem kıkırdağı ECM'sinin bozulmasından sorumlu proteazların belirlenmesine odaklanmıştır. Modern kavramlara göre, matris metaloproteazlar (MMP'ler) osteoartrozun patogenezinde önemli bir rol oynar. Osteoartrozlu hastalarda, üç MMP'nin artmış seviyesi tespit edilir - kolajenazlar, stromelisinler ve jelatinazlar. Kolajenaz, doğal kolajenin, stromelisin - tip IV kolajenin, proteoglikanların ve lamininin bozulmasından, jelatinaz - jelatinin, kolajenlerin IV, Vh XI tiplerinin, elastinin bozulmasından sorumludur. Ek olarak, MMP'lerin özelliklerine sahip olan ve kıkırdaklı proteoglikan agregatlarının proteolizinden sorumlu olan başka bir enzim - agrekanazın varlığı varsayılmaktadır.

İnsan eklem kıkırdağında üç tip kolajenaz tanımlanmıştır ve bu kolajenazların seviyeleri osteoartritli hastalarda önemli ölçüde yükselmiştir: kolajenaz-1 (MMP-1), kolajenaz-2 (MMP-8) ve kolajenaz-3 (MMP-13). Eklem kıkırdağında üç farklı tip kolajenazın bir arada bulunması, her birinin kendine özgü bir rol oynadığını düşündürmektedir. Gerçekten de, kolajenaz-1 ve -2 esas olarak eklem kıkırdağının yüzeysel ve üst ara bölgesinde yer alırken, kolajenaz-3 alt ara bölgede ve derin bölgede bulunur. Dahası, immünohistokimyasal çalışmanın sonuçları, osteoartrit ilerledikçe kolajenaz-3 seviyesinin bir platoya ulaştığını ve hatta azaldığını, kolajenaz-1 seviyesinin ise kademeli olarak arttığını göstermiştir. Osteoartritte kolajenaz-1'in esas olarak eklem kıkırdağındaki inflamatuar süreçte yer aldığına, kolajenaz-3'ün ise doku yeniden şekillenmesinde yer aldığına dair kanıtlar vardır. OA hastalarının kıkırdaklarında eksprese edilen kolajenaz-3, kolajenaz-1'den daha yoğun bir şekilde tip II kolajeni parçalar.

İkinci metaloproteaz grubunun temsilcilerinden üçü insan stromelisininde de tanımlanmıştır: stromelisin-1 (MMP-3), stromelisin-2 (MMP-10) ve stromelisin-3 (MMP-11). Günümüzde sadece stromelisin-1'in osteoartrozdaki patolojik süreçte yer aldığı bilinmektedir. Stromelisin-2 osteoartrozlu hastaların sinovyal membranında tespit edilmez, ancak romatoid artritli hastaların sinovyal fibroblastlarında çok küçük miktarlarda bulunur. Stromelisin-3 ayrıca romatoid artritli hastaların sinovyal membranında fibroblastlara yakın, özellikle fibroz bölgelerinde bulunur.

İnsan kıkırdak dokusundaki jelatinazlar grubunda sadece ikisi tanımlanmıştır: 92 kD jelatinaz (jelatinaz B veya MMP-9) ve 72 kD jelatinaz (jelatinaz A veya MMP-2); osteoartritli hastalarda 92 kD jelatinaz düzeyinde artış saptanır.

Son zamanlarda, hücre zarlarının yüzeyinde lokalize olan ve zar tipi MMP'ler (MMP-MT) olarak adlandırılan başka bir MMP grubu tanımlanmıştır. Bu grup dört enzimi içerir - MMP-MT1 - MMP-MT-4. MMP-MT ekspresyonu insan eklem kıkırdağında bulunmuştur. MMP-MT-1'in kolajenaz özellikleri olmasına rağmen, hem MMP-MT-1 hem de MMP-MT-2 enzimleri jelatinaz-72 kDa ve kolajenaz-3'ü aktive edebilir. Bu MMP grubunun OA patogenezindeki rolünün açıklığa kavuşturulması gerekmektedir.

Proteinazlar, diğer proteinazlar veya organik cıva bileşikleri tarafından aktive edilen bir zimogen formunda salgılanır. MMP'lerin katalitik aktivitesi, enzimin aktif bölgesinde çinkonun varlığına bağlıdır.

MMP'lerin biyolojik aktivitesi spesifik TIMP'ler tarafından kontrol edilir. Bugüne kadar, insan eklem dokularında bulunan üç tip TIMP tanımlanmıştır: TIMP-1–TIMP-3. Dördüncü bir TIMP tipi tanımlanmış ve klonlanmıştır, ancak henüz insan eklem dokularında tespit edilmemiştir. Bu moleküller spesifik olarak MMP'lerin aktif bölgesine bağlanır, ancak bazıları 72 kD projelatinazın (TIMP-2, -3, -4) ve 92 kD projelatinazın (TIMP-1 ve -3) aktif bölgesine bağlanabilir. Kanıtlar, OA'da eklem kıkırdağında MMP'ler ve TIMP'ler arasında bir dengesizlik olduğunu ve bunun muhtemelen kısmen dokudaki aktif MMP seviyesindeki artıştan kaynaklanan inhibitörlerin göreceli eksikliğine yol açtığını göstermektedir. TIMP-1 ve -2 eklem kıkırdağında bulunur ve kondrositler tarafından sentezlenir. Osteoartrozda, sinovyal membran ve sinovyal sıvıda yalnızca tip I TIMP saptanır. TIMP-3 yalnızca ECM'de bulunur. TIMP-4, amino asit dizisinin neredeyse %50'sini TIMP-2 ile ve %38'ini TIMP-1 ile paylaşır. Diğer hedef hücrelerde, TIMP-4 hücre yüzeyindeki 72 kD projelatinazın aktivasyonunu modüle etmekten sorumludur ve bu da ECM yeniden modellemesinin dokuya özgü düzenleyicisi olarak önemli bir rol oynadığını gösterir.

MMP'lerin biyolojik aktivitesini kontrol etmek için bir diğer mekanizma da fizyolojik aktivasyonlarıdır. Serin ve sistein proteaz ailesinden AP/plazmin ve katepsin B gibi enzimlerin sırasıyla MMP'lerin fizyolojik aktivatörleri olduğuna inanılmaktadır. Osteoartritli hastaların eklem kıkırdaklarında ürokinaz (uAP) ve plazmin düzeylerinin arttığı bulunmuştur.

Eklem dokularında çeşitli katepsin tipleri bulunmasına rağmen, katepsin-B kıkırdaktaki MMP'lerin en olası aktivatörü olarak kabul edilir. İnsan eklem dokularında serin ve sistein proteazlarının fizyolojik inhibitörleri bulunmuştur. AP-1 inhibitörünün (IAI-1) ve sistein proteazlarının aktivitesi osteoartritli hastalarda azalır. MMP/TIMP'ye benzer şekilde, serin ve sistein proteazları ile inhibitörleri arasındaki dengesizlik, osteoartritli hastaların eklem kıkırdaklarındaki MMP'lerin artmış aktivitesini açıklayabilir. Ek olarak, MMP'ler birbirlerini aktive edebilir. Örneğin, stromelisin-1 kolajenaz-1, kolajenaz-3 ve 92 kD jelatinaz'ı aktive eder; kolajenaz-3 92 kD jelatinaz'ı aktive eder; MMP-MT kolajenaz-3'ü aktive eder ve jelatinaz-72 kDa bu aktivasyonu güçlendirir; MMP-MT ayrıca jelatinaz 72 kDa'yı aktive eder. Sitokinler üç gruba ayrılabilir - yıkıcı (inflamatuar), düzenleyici (anti-inflamatuar dahil) ve anabolik (büyüme faktörleri).

Sitokin türleri (van den Berg WB ve diğerlerine göre)

Yıkıcı	İnterlökin-1 TNF-a Lösemi inhibitör faktörü İnterlökin-17
Düzenleyici	İnterlökin-4 İnterlökin-10 İnterlökin-13 Enzim inhibitörleri
Anabolik	İnsülin benzeri büyüme faktörleri TGF-b Kemik morfogenetik proteinleri Kıkırdaktan türetilen morfogenetik proteinler

Yıkıcı sitokinler, özellikle IL-1, proteazların salınımında bir artışa neden olur ve kondrositler tarafından proteoglikanların ve kolajenlerin sentezini engeller. Düzenleyici sitokinler, özellikle IL-4 ve -10, IL-1 üretimini engeller, IL-1 reseptör antagonisti (IL-1RA) üretimini artırır ve kondrositlerdeki NO sentaz seviyesini azaltır. Böylece IL-4, IL-1'e üç yönde karşı koyar: 1) üretimini azaltır, etkilerini önler, 2) ana "temizleyici" IL-1RA'nın üretimini artırır ve 3) ana sekonder "haberci" NO'nun üretimini azaltır. Ek olarak, IL-4 dokuların enzimatik bozunmasını azaltır. İn vivo olarak, optimum terapötik etki IL-4 ve IL-10 kombinasyonu ile elde edilir. TGF-β ve IGF-1 gibi anabolik faktörler aslında IL-1'in üretimine veya etkisine müdahale etmezler, fakat ters etki gösterirler, örneğin proteoglikan ve kollajen sentezini uyarırlar, proteazların aktivitesini baskılarlar ve TGF-β ayrıca enzimlerin salınımını inhibe eder ve inhibitörlerini uyarır.

Proinflamatuar sitokinler, eklem dokularında MMP'lerin artan sentezinden ve ekspresyonundan sorumludur. Sinovyal membranda sentezlenirler ve daha sonra sinovyal sıvı yoluyla eklem kıkırdağına yayılırlar. Proinflamatuar sitokinler, proinflamatuar sitokinler üretme yeteneğine sahip olan kondrositleri aktive eder. Osteoartrozdan etkilenen eklemlerde, inflamasyon efektörünün rolü esas olarak sinovyal membran hücreleri tarafından oynanır. Proteazları ve inflamasyon medyatörlerini salgılayan makrofaj tipi sinovositlerdir. Bunlar arasında IL-f, TNF-a, IL-6, lösemi inhibitör faktörü (LIF) ve IL-17, osteoartrozun patogenezinde en çok "yer alan"lardır.

Osteoartritte eklem kıkırdağının bozulmasını uyaran biyolojik olarak aktif maddeler

• İnterlökin-1
• İnterlökin-3
• İnterlökin-4
• TNF-a
• Koloni uyarıcı faktörler: makrofaj (monosit) ve granülosit-makrofaj
• Madde P
• SAYFA ₂
• Plazminojen aktivatörleri (doku ve ürokinaz tipleri) ve plazmin
• Metalloproteazlar (kolajenazlar, ellastazlar, stromelisinler)
• Katepsinler A ve B
• Trilsin
• Bakteriyel lipopolisakkaritler
• Fosfolipaz Ag

Literatür verileri, IL-1 ve muhtemelen TNF-a'nın osteoartrozda eklem dokusu yıkımının ana aracıları olduğunu göstermektedir. Ancak, bunların birbirlerinden bağımsız mı hareket ettikleri yoksa aralarında işlevsel bir hiyerarşi olup olmadığı hala bilinmemektedir. Osteoartrozun hayvan modelleri, IL-1 blokajının eklem kıkırdağı yıkımını etkili bir şekilde önlediğini, TNF-a blokajının ise yalnızca eklem dokularındaki inflamasyonu azalttığını göstermiştir. Her iki sitokinin de artan konsantrasyonları hastaların sinovyal membranında, sinovyal sıvısında ve kıkırdağında bulunmuştur. Kondrositlerde, yalnızca proteazların (esas olarak MMP ve AP) değil, aynı zamanda tip I ve III gibi minör kolajenlerin sentezini artırabilir ve tip II ve IX kolajenlerinin ve proteoglikanların sentezini azaltabilirler. Bu sitokinler ayrıca reaktif oksijen türlerini ve PGE2 gibi inflamatuar medyatörleri de _uyarır. Osteoartritte eklem kıkırdağında meydana gelen bu tür makromoleküler değişikliklerin sonucu, onarım süreçlerinin etkisiz kalmasıdır; bu da kıkırdağın daha da bozulmasına yol açar.

Yukarıda belirtilen proinflamatuar sitokinler osteoartrozda MMP baskılanması/aktivasyonu süreçlerini düzenler. Örneğin, osteoartrozda kıkırdaktaki TIMP-1 ve MMP seviyeleri arasındaki dengesizlik IL-1 tarafından aracılık edilebilir, çünkü in vitro bir çalışma IL-1 beta konsantrasyonlarındaki artışın TIMP-1 konsantrasyonlarında bir azalmaya ve kondrositler tarafından MMP sentezinde bir artışa yol açtığını göstermiştir. AP sentezi de IL-1 beta tarafından düzenlenir. Eklem kıkırdak kondrositlerinin IL-1 ile in vitro uyarılması AP sentezinde doza bağlı bir artışa ve iAP-1 sentezinde keskin bir azalmaya neden olur. IL-1'in iAP-1 sentezini azaltma ve AP sentezini uyarma yeteneği plazmin üretimi ve MMP aktivasyonu için güçlü bir mekanizmadır. Ek olarak, plazmin sadece diğer enzimleri aktive eden bir enzim değildir, aynı zamanda doğrudan proteoliz yoluyla kıkırdak bozunma sürecine de katılır.

IL-ip, 31 kD kütleli inaktif bir öncül olarak sentezlenir (pre-IL-ip) ve daha sonra sinyal peptidinin kesilmesinden sonra 17,5 kD kütleli aktif bir sitokine dönüştürülür. Sinovyal membran, sinovyal sıvı ve eklem kıkırdağı dahil olmak üzere eklem dokularında IL-ip aktif bir formda bulunur ve in vivo çalışmalar osteoartrozdaki sinovyal membranın bu sitokini salgılama yeteneğini göstermiştir. Bazı serin proteazlar pre-IL-ip'yi biyoaktif formuna dönüştürebilir. Memelilerde, bu özellikler yalnızca sistein aspartat-spesifik enzimler ailesine ait olan ve IL-1β-dönüştürücü enzim (ICF veya kaspaz-1) olarak adlandırılan bir proteazda bulunmuştur. Bu enzim pre-IL-ip'yi 17,5 kD kütleli biyolojik olarak aktif "olgun" IL-ip'ye spesifik olarak dönüştürebilir. ICF, hücre zarında lokalize olan 45 kD proenzimdir (p45). p45 proenziminin proteolitik parçalanmasından sonra, enzimatik aktivite ile karakterize edilen p10 ve p20 olarak bilinen iki alt birim oluşur.

TNF-a ayrıca 26 kDa kütleye sahip bir zarla bağlı öncül olarak sentezlenir; proteolitik bölünmeyle hücreden 17 kDa kütleye sahip aktif bir çözünür form olarak salınır. Proteolitik bölünme, adamalizin ailesine ait olan TNF-a dönüştürücü enzim (TNF-AC) tarafından gerçekleştirilir. AR Amin ve diğerleri (1997), osteoartritli hastaların eklem kıkırdaklarında TNF-AC mRNA'nın ekspresyonunun arttığını buldular.

Kondrositlerin ve sinovositlerin IL-1 ve TNF-a tarafından biyolojik aktivasyonu, hücre yüzeyindeki spesifik reseptörlere - IL-R ve TNF-R - bağlanarak aracılık edilir. Her sitokin için iki tip reseptör tanımlanmıştır - IL-IP tip I ve II ve TNF-R tip I (p55) ve II (p75). IL-1PI ve p55, eklem dokusu hücrelerinde sinyal iletiminden sorumludur. IL-1R tip I, IL-1a'ya göre IL-1beta'ya biraz daha yüksek bir afiniteye sahiptir; IL-1R tip II ise, aksine, IL-ip'ye göre IL-1a'ya daha yüksek bir afiniteye sahiptir. IL-IP tip II'nin IL-1 sinyallerini aracılık edip etmediği veya yalnızca IL-1'in IL-1R tip I ile ilişkisinin rekabetçi inhibisyonuna hizmet edip etmediği belirsizliğini korumaktadır. Osteoartrozlu hastaların kondroitleri ve sinovyal fibroblastları büyük miktarda IL-1PI ve p55 içerir ve bu da bu hücrelerin ilgili sitokinler tarafından uyarılmaya karşı yüksek duyarlılığını açıklar. Bu süreç hem proteolitik enzimlerin salgılanmasının artmasına hem de eklem kıkırdağının tahribatına yol açar.

IL-6'nın osteoartritteki patolojik süreçteki rolü göz ardı edilemez. Bu varsayım aşağıdaki gözlemlere dayanmaktadır:

• IL-6 sinovyal membrandaki inflamatuar hücre sayısını artırır.
• IL-6 kondrosit proliferasyonunu uyarır,
• IL-6, IL-1'in MMP sentezini artırma ve proteoglikan sentezini inhibe etme etkilerini güçlendirir.

Ancak IL-6, TIMP üretimini indükleyebilme yeteneğine sahipken, MMP üretimini etkilemediğinden, bu sitokinin, geri bildirim mekanizmasıyla gerçekleştirilen eklem kıkırdağının proteolitik yıkımını engelleme sürecinde rol oynadığı düşünülmektedir.

IL-6 ailesinin bir diğer üyesi, proinflamatuar sitokinler IL-1p ve TNF-a tarafından uyarıma yanıt olarak osteoartrozlu hastalardan alınan kondrositler tarafından üretilen bir sitokin olan LIF'dir. LIF, kıkırdak proteoglikan rezorpsiyonunu ve MMP sentezini ve NO üretimini uyarır. Bu sitokinin osteoartrozdaki rolü tam olarak açıklanmamıştır.

IL-17, IL-1 benzeri etkiye sahip 20-30 kD'lik bir homodimerdir, ancak çok daha az belirgindir. IL-17, insan makrofajları gibi hedef hücrelerde IL-1p, TNF-a, IL-6 ve MMP dahil olmak üzere bir dizi proinflamatuar sitokinin sentezini ve salınımını uyarır. Ek olarak, IL-17 kondrositler tarafından NO üretimini uyarır. LIF gibi, IL-17'nin OA patogenezindeki rolü yeterince araştırılmamıştır.

İnorganik serbest radikal NO, OA'da eklem kıkırdağının bozulmasında önemli bir rol oynar. Osteoartritli hastalardan izole edilen kondrositler, normal hücrelere kıyasla hem kendiliğinden hem de proinflamatuar sitokinlerle uyarıldıktan sonra daha yüksek miktarda NO üretir. Osteoartritli hastaların sinovyal sıvısında ve serumunda yüksek NO içeriği bulunmuştur - bu, NO üretiminden sorumlu enzim olan indüklenen NO sentazın (hNOC) artan ekspresyonu ve sentezinin bir sonucudur. Son zamanlarda, kondrosit-spesifik hNOC'nin DNA'sı klonlandı ve enzimin amino asit dizisi belirlendi. Amino asit dizisi, endotel ve sinir dokusuna özgü hNOC ile %50 özdeşlik ve %70 benzerlik göstermektedir.

NO, eklem kıkırdağının ECM'sinin makromoleküllerinin sentezini inhibe eder ve MMP sentezini uyarır. Dahası, NO üretimindeki artışa kondrositler tarafından IL-IP antagonisti (IL-1RA) sentezinde bir azalma eşlik eder. Bu nedenle, IL-1 seviyesindeki artış ve IL-1RA'daki azalma, kondrositlerde NO'nun aşırı uyarılmasına yol açar ve bu da kıkırdak matrisinin artan degradasyonuna yol açar. Seçici bir hNOC inhibitörünün deneysel osteoartrozun ilerlemesi üzerindeki in vivo terapötik etkisine dair raporlar vardır.

Doğal sitokin inhibitörleri, sitokinlerin hücre zarı reseptörlerine bağlanmasını doğrudan önleyerek proinflamatuar aktivitelerini azaltabilir. Doğal sitokin inhibitörleri, etki biçimlerine göre üç sınıfa ayrılabilir.

Birinci sınıf inhibitörler, ligandın reseptörüne bağlanmasını bağlanma yeri için rekabet ederek engelleyen reseptör antagonistlerini içerir. Bugüne kadar, böyle bir inhibitör yalnızca IL-1 için bulunmuştur - bu, yukarıda belirtilen IL-1/ILIP sisteminin rekabetçi inhibitörüdür IL-1 PA. IL-1 PA, osteoartritte eklem dokularında gözlenen birçok etkiyi engeller; bunlar arasında sinovyal hücreler tarafından prostaglandin sentezi, kondrositler tarafından kolajenaz üretimi ve eklem kıkırdağının BM'sinin parçalanması bulunur.

IL-1RA farklı formlarda bulunur - bir çözünür (rIL-1RA) ve iki hücre içi (μIL-lPAI ve μIL-1RAP). IL-1RA'nın çözünür formunun afinitesi, hücreler arası formların afinitesinden 5 kat daha yüksektir. Yoğun bilimsel araştırmalara rağmen, ikincisinin işlevi bilinmemektedir. İn vitro deneyler, IL-1beta aktivitesinin inhibisyonunun normalden 10-100 kat daha yüksek bir IL-1RA konsantrasyonu gerektirdiğini, in vivo koşullarının ise IL-1RA konsantrasyonunda bin kat artış gerektirdiğini göstermiştir. Bu gerçek, osteoartrozlu hastaların sinovyumunda IL-1RA'nın göreceli eksikliğini ve IL-1'in fazlalığını kısmen açıklayabilir.

İkinci doğal sitokin inhibitörleri sınıfı çözünür sitokin reseptörleridir. İnsanlarda osteoartrit patogeneziyle ilişkili bu tür inhibitörlerin örnekleri rIL-1R ve pp55'tir. Çözünür sitokin reseptörleri normal reseptörlerin kısaltılmış formlarıdır; sitokinlere bağlandıklarında, hedef hücrelerin membranla ilişkili reseptörlerine bağlanmalarını önlerler ve rekabetçi antagonizma mekanizmasıyla etki ederler.

Çözünebilir reseptörlerin ana öncüsü membrana bağlı IL-1RP'dir. rIL-IP'nin IL-1 ve IL-1RA'ya olan afinitesi farklıdır. Bu nedenle, rIL-1RN'nin IL-1β'ye olan afinitesi IL-1RA'ya olan afinitesinden daha yüksektir ve rIL-1PI'nin IL-1RA'ya olan afinitesi IL-ip'ye olan afinitesinden daha yüksektir.

Ayrıca TNF için iki tip çözünür reseptör vardır - pp55 ve pp75, çözünür IL-1 reseptörleri gibi, "dökülme" yoluyla oluşurlar. Her iki reseptör de canlıda etkilenen eklemlerin dokularında bulunur. Çözünür TNF reseptörlerinin osteoartroz patogenezindeki rolü tartışılmaktadır. Düşük konsantrasyonlarda TNF'nin üç boyutlu yapısını stabilize ettikleri ve biyoaktif sitokinin yarı ömrünü artırdıkları varsayılırken, yüksek konsantrasyonlarda pp55 ve pp75, rekabetçi antagonizma yoluyla TNF aktivitesini azaltabilir. Muhtemelen, pp75 bir TNF taşıyıcısı olarak hareket edebilir ve membranla ilişkili reseptöre bağlanmasını kolaylaştırabilir.

Üçüncü doğal sitokin inhibitörleri sınıfı, TGF-beta, IL-4, IL-10 ve IL-13'ü içeren bir grup anti-inflamatuar sitokin tarafından temsil edilir. Anti-inflamatuar sitokinler, pro-inflamatuar ve bazı proteazların üretimini azaltır ve IL-1RA ve TIMP üretimini uyarır.